화장품의 미생물한도 기준 및 시험방법 가이드라인(안)
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( 2006년 7월 24일 식품의약품안전청 )

○ 식품의약품안전청에서는  “화장품의 미생물한도 기준 및 시험방법 가이드라인(안)”을 마련하였다. 

- 이 가이드라인(안)은 화장품 중 눈화장용제품류 및 어린이용제품류에 대하여 미생물한도를 설정하고 있으며, 그 기준을 총호기성생균수는 1g(ml)당 500개 이하, 대장균, 녹농균, 황색포도상구균은 검출되면 안 되는 것으로 정하고 있다. 

○ 식품의약품안전청에서는 최근 천연화장품에서 미생물이 검출되는 등 화장품의 미생물한도시험법 마련의 필요성이 대두되어 본 가이드라인(안)을 제정하게 되었다고 밝혔다. . 

○ 이 화장품의 미생물한도 기준 및 시험방법 가이드라인(안)은 화장품 업계 등  각계의 의견을 수렴하여 올 연말까지 가이드라인으로 제정될 예정이다. 

아래는 가이드라인(안) 중에서 일부를 게재하였으며 전문은 첨부하였슴
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I. 서론
 
 1. 일반적으로 화장품에는 오염된 미생물이 증식할 가능성이 있다. 오염된 미생물은 화장품의 품질을 떨어뜨리고 소비자의 건강에 나쁜 영향을 미칠 수 있다. 그러므로 화장품 제조자는 화장품의 품질, 안전성, 유효성을 확보하기 위하여 화장품 원료, 화장품과 직접 접촉하는 용기나 포장 및 최종제품의 미생물 오염을 최대한 낮게 억제해야 한다.

 2. 미생물한도시험은 화장품에 존재하는 살아있는 세균 및 진균의 수를 측정하여 그 한도 기준을 정한 것으로 화장품이 미생물에 오염되었는지 여부를 확인할 수 있다. 

 3. 이 가이드라인은 화장품을 제조하는데 있어 위생과 안전에 대한 개념을 강조하고, 화장품에 미생물한도기준을 적용하도록 함으로서 화장품 제조자가 미생물에 대한 품질관리 프로그램을 설정하고 유지하도록 도움을 주고 소비자에게 안전한 화장품을 공급하기 위한 것이다. 


II. 미생물시험

 1. 용어정의
  ○ 세균 : 단세포생물이며 원핵생물로서 일반적으로 최적성장온도는 30～35 ℃이다. 그람양성 및 음성으로 구별되며 그람양성에는 식중독을 일으키는 포도상구균이, 그람음성에는 심내막염․폐렴․수막염․폐혈증을 일으키는 녹농균, 장내설사, 복통을 일으키는 살모넬라균 등이 이에 속한다.
  ○ 진균 : 포자를 형성하면서 증식하는 곰팡이, 효모가 이에 속하며, 최적성장온도는 20～25 ℃이다. 곰팡이는 병원 내 공기감염을 일으키는 것이 있으며 페니실린 등을 생산하는 것도 있다. 효모는 빵, 맥주의 발효 시 사용된다.
  ○ 콜로니 : 고체배지에서 균을 배양할 때 육안으로 관찰되는 동일한 균의 세포덩어리  
  ○ 멸균 : 물질 중에서 모든 미생물을 죽이든가 또는 없애는 것을 말한다. 멸균법은 일반적으로 미생물의 종류, 오염상태, 멸균하고자 하는 물질의 성질 및 상태에 따라 정한다.

 2. 미생물시험에 사용되는 기구 및 기기

  1) 기구 : 멸균피펫, 멸균핀셋, 멸균가위, 멸균약수저(spatula), 멸균시험관, 멸균병, 멸균페트리디쉬, 멸균유리봉
  2) 기기
   ○ 클린벤치(clean bench) : 헤파필터(Hepa filter)가 붙은 라미나 플로우 후드(laminar flow hood)로 미생물시험에 이용하는 무균장치. 챔버 내부의 양압으로 외부 공기의 흡입이 방지되며 청정도는 클래스 100으로 유지한다.
   ○ 고압증기멸균기 : 배지 및 기구의 멸균에 사용한다.
   ○ 건열기 : 기구의 건조 또는 멸균에 사용한다.
   ○ 배양기 : 30～35 ℃범위에서 일정온도를 유지하는 항온 세균배양기와  20～25 ℃ 범위에서 일정온도를 유지하는 항온 진균배양기를 사용한다.
   ○ 알코올 램프 및 가스버너 

 3. 미생물성장에 영향을 주는 요인

  1) 영양분 
    미생물의 생존과 발육에는 물을 비롯하여 영양물질이 필요하며, 이러한 영양물질로서 무기 또는 유기화합물을 배양액에서 공급해주어야 한다. 독립영양, 종속영양 등 영양형태에 따라 필요로 하는 영양원은 여러 가지인데 보통 탄소원, 질소원, 무기염류, 발육인자 등으로 나누어서 생각한다. 
    미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위하여 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 한 것을 배지라고 한다. 특히 발육인자와 관련하여 생물체 내에서 추출한 비교적 복잡한 조성을 가진 것을 천연배지라고 하며 세균은 육즙, 혈청 등을, 진균은 맥아엑스 등이 흔히 이용된다. 이에 비하여 무기염류 또는 맥아엑스 등이 아닌 탄소원, 질소원을 따로 가한 조성이 명확한 경우를 합성배지라 한다. 대량 배양에는 액체배지가 적절하고, 균주의 보존이나 분리에는 한천·젤라틴 등을 가한 고형배지가 많이 사용된다. 많은 종류의 세균을 포함하는 재료로부터 특정 목적균을 추출하기 위한 배지를 선택배지라고 한다. 배지는 완전히 멸균한 후에 목적균을 심지 않으면 잡균이 증식될 염려가 있기 때문에 배지를 보존하기 위해서는 반드시 멸균을 하여야 한다. 
  2) 배지의 물리적인 상태 
    미생물시험배지는 액체상태, 반고체상태, 고체상태가 있다. 액체배지는 배지를 이루고 있는 성분을 녹여 놓은 액체상태의 배지이며 여기에 한천 1.5%나 젤라틴 12%를 첨가하면 배지는 반고체상태가 되고 한천 15～20 %를 첨가하게 되면 고체상태가 된다. 끓는점 부근까지 가열하면 다시 액체로 되고 45 ℃보다 낮아지면 한천은 굳어지며, 젤라틴은 20 ℃보다 낮아지면 굳어진다. 
  3) 온도
    미생물은 광범위한 온도에서 자란다. 냉온성균주(psychrophile,  cryophile)는 -4 ～ 15 ℃에서 자라고, 중온성균주(mesophile)는 15 ℃ ～ 45 ℃에서 자라며 대다수의 미생물은 이 그룹에 속한다. 내열성균주(thermophile)는 50～80 ℃에서 자라며, 몇몇 미생물은 90 ℃보다 높은 온도에서 자라는 경우도 있다. 
    냉온성균주는 대부분 효소활성이 저해되는 온도에서도 기능을 할 수 있는 효소체계를 가지고 있기 때문에 낮은 온도에서도 자랄 수 있다. 음식에 존재하는 저온성균은 냄새나 성상을 변하게 한다. 냉장고에 보관해 둔 햄버거가 며칠 후 오염 되거나 냉장고에 보관해 둔 과일에 곰팡이가 생기는 것 등은 저온성균주가 성장하여 나타나는 것이다. 중온성균주는 10～30 ℃에서 자라는 것과 15～45 ℃에서 자라는 것의 두 개 그룹으로 나뉘는데, , 특히 37 ℃의 생체내 온도에서 자라는 것이 있는데 이 균들은 인체서식균주이며 사람이나 따뜻한 피가 흐르는 동물들은 중온성균주의 숙주가 된다.
  4) 산소
    미생물에 따라 미생물의 성장시 산소에 대한 요구도 다양하다. 산소가 있을 때만 자라는 균주는 편성호기성균이라고 하고 액체 배지표면에서 층을 형성하면서 자란다. 산소가 없을 때만 자라는 균주는 편성혐기성균이라고 하며, 산소의 유무와 무관하게 자라는 균주는 통성혐기성균이라고 한다. 또한 공기압보다 낮은 분압의 산소를 요구하는 균주는 미호기성균(microaeophile)이라고 하며, 이것은 산소를 감소시키기보다 오히려 이산화탄소의 비율을 증가시켜야 한다. 
  5) 배지의 삼투압
    세균의 세포는 osmotic machine으로 세포의 형태와 관계없이 여과기 형태를 가진 수많은 구멍을 가진 세포벽을 가지고 있다. 세포벽안에는 반투과성 막이 있으며 그 막은 세포의 세포질(cytoplasm), 염색체(chromosome) 및 그 밖의 세포기관(organelle)으로 이루어져 있다. 영양브로스(Nutrient broth)에서 자란 세균을 15 % 당이 함유된 용액에 넣으면, 당에 의해 삼투압의 차이가 나게 되어 세포안의 물이 세포막을 통해 빠져 나와 세포벽안의 압력을 낮추게 되므로 세포벽이 쭈그러들게 된다. 반대로, 당을 함유하는 용액에서 자란 세균을 증류수로 넣게 되면, 삼투압차에 의해 세포가 터지게 된다. 이러한 삼투압의 영향은 배지에 사용되는 영양소원들의 농도에 따른다. 보통 미생물은  염화나트륨 12%보다 높은 농도를 지탱할 수가 없으며, 잼이나 젤리가 잘 오염되지 않는 것은 바로 높은 당 농도 때문이다. 생화학적 분석을 위해 세포를 증류수에 넣으면 세포가 터져서 세포내의 물질이 방출된다. 
  6) 배지의 액성(pH)
    미생물 성장의 중요한 요소 중 하나는 수소이온(H+)과 알칼리이온(OH-) 농도이다. 정제수에는 수소이온과 알칼리이온이 매우 낮은 농도로 존재한다. 물에 산이 첨가되면 이온화가 이루어진다. 염산과 같은 강산에서는 실제로 대부분의 분자가 이온화되는 반면, 약산에서는 약 1 %만이 이온화한다. 실제적으로 이온화되는 정도는 온도와 농도에 따라 다르게 된다. pH 1～5에서 자라는 균을 호산성균(acidophile)이라고 하며, pH 5.5 나 6～8에서 자라는 균주를 호중성균(neutrophile)이라고 하며, pH 7.5～10에서 자라는 균주를 호염기성균(basophile)이라고 한다. 일반적으로 대부분의 세균은 pH 6～8의 범위에서 자라며, 대부분의 곰팡이와 효소는 pH 2.5～5.5의 범위에서 자란다. 예를 들면 비브리오 콜레라균은 pH 9의 배지에서 분리되며, 이러한 성질을 이용하여 선택배지로 균을 분리하기도 한다. 
  7) 완충제(buffers)
    당을 발효시켜 산을 생성함으로서 배지가 산성을 띄게 되거나 아미노산의 탈아미노반응에 따라 배지에 알칼리를 방출함으로서 알칼리성을 띄게 되는 경우 세균의 성장은 멈추거나 자라지 못하게 된다. 이렇게 산이나 염기가 생성될 때 배지의 pH가 쉽게 변하는 것을 방지하기 위하여 완충제를 사용한다. 가장 일반적으로 이용되는 것에는 인산일수소칼륨과 인산이수소칼륨이 있으며 탄산칼슘과 그 이외의 물질을 이용하기도 한다. 펩톤은 영양공급원으로 첨가되지만 완충작용을 나타내기도 한다. 
  8) 부유, 분리, 선택배지
    많은 병원성세균은 일반적인 영양한천배지(nutrient agar)에서 잘 자라지 않는다. 부유배지는 전체의 혈액, 혈청, 혈장, 복수(ascitic acid), 효모추출물 등이 첨가되어 배양조건이 까다로운 균주도 잘 성장하도록 한다. 
    분리배지는 균 배양시 빠른 성장과 함께 분명하고 쉽게 분리되는 집락모양을 갖도록 함으로서 2종이상의 세균을 가진 검체에서 그 중 하나의 균을 검출하는 배지를 말한다. 한 예로 levine의 EMB배지는 E. coli의 분리배지로서 1 % 유당을 첨가하여 빠르게 자라게 하며, 염색약인 에오신과 메칠렌블루를 첨가하여 녹색금속광택을 띤 검정색 집락을 형성하게 된다. Enterobacter aerogenes균 같이 E. coli와 유사한 균은 EMB배지에서 잘 자라기는 하지만, 집락 모양이 크고 갈색 점액성의 집락을 갖게 되기 때문에 구별이 가능하다. 
    선택배지는 주로 한천배지이며, 상재균의 발육으로 병원균의 발육이 곤란한 경우 목적이외의 균발육을 억제시키는 배지이다(예 : 살모넬라 시겔라 배지, 맥콘키 배지, 스타필로코쿠스 110 배지 등).  S-S(Salmonella-Shigella)배지는 salmonella와 shigella의 선택배지로 담즙산염과 염색약을 억제제로 사용하는데 분변 현탁액이나 분변을 배지에 발라주게 되면 salmonella와 shigella는 무색의 집락을 형성하게 되나, 분변의 주요 균종인 E. coli는 이 배지에서 성장하지 못하게 된다.