화장품 미생물 허용 기준 및 시험법         

1. 허용 기준

ｏ 눈 화장용 제품, 어린이용 제품 :
- 총 호기성 생균(세균, 진균) 수 : 500 CFU/g(mL) 이하
- 대장균(Escherichia coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 제품 0.1g(ml)에서 검출되어서는 안된다.

2. 시험 대상 제품

ｏ 눈화장용 제품류 : 아이라이너, 아이섀도, 마스카라, 아이메이크업 리무버
ｏ 어린이용 제품류 : 어린이용 샴푸, 어린이용 로션 및 크림, 어린이용 오일(수분이 함유되지 않은 제품의 경우는 제외한다.)


3. 미생물 시험법

이 시험법은 화장품 중의 총 호기성 생균(세균, 진균)수를 측정하고, 특정 세균인 대장균, 녹농균 및 황색포도상구균의 유무를 시험하는 방법이다.

본 시험법 외에 아래의 시험법을 적용 할 수도 있다.
ｏ CTFA, Microbiology guidelines
ｏ Colipa, Guidelines on microbial Quality Management
ｏ 일본화장품공업연합회, 화장품 미생물한도 시험법
ｏ 적절한 방법으로 검증된 자동화 장비를 이용한 시험법

3.1. 검체의 전처리
제품은 무작위로 선별하여 그 내용물의 일부분을 검체로 한다. 검체 조작은 무균 조건하에서 실시하여야 하며, 검체의 특성에 따라 다음의 각 방법으로 검체를 희석, 용해, 부유 또는 현탁시킨다.

3.1.1 수분산 검체
검체 1g(mL)에 희석액 9mL을 넣어 10배로 희석하고 필요시 추가로 희석한다. 수분산 검체란 희석액에 균일한 성상으로 분산 가능한 제형의 검체를 말하며, 가용화 제형, O/W 유화 제형 등을 포함한다.

3.1.2 비수분산 검체
검체 1g(mL)에 폴리소르베이트 80을 1mL을 넣어 균질화 시키고 희석액 8mL을 넣어 10배로 희석하고 필요시 추가로 희석한다. 균질화 되지 않을 경우 5 mm 유리구슬 5~7개(3mm 유리구슬 10~15개)를 넣어 균질화시킨다. 비수분산 검체란 희석액에 균일한 성상으로 용이하게 분산되지 않는 제형의 검체를 말하며, W/O 유화 제형, 분체 제품 등을 포함한다.

3.2. 총 호기성 생균수 시험법
총 호기성 생균수 시험법은 화장품 중 총 호기성 생균(세균, 진균)수를 측정하는 시험법이다.
총 호기성 생균수는 검출된 세균수와 진균수의 합으로 한다.

3.2.1 한천평판 희석법

3.2.1.1 검액의 조제
레틴 액체 배지(Modified letheen broth) 또는 다른 적당한 항균작용이 나타나지 않는 배지를 사용하여 1)항에 따라 검액을 조제한다.

3.2.1.2 배지

3.2.1.2.1 희석액
하기의 희석액을 사용하는 것을 원칙으로 하며 “방부제 중화능 시험”을 통해 검증된 다른 희석액도 사용 가능하다.
- 변형 레틴 액체 배지(Modified letheen broth)
- 레틴 액체 배지(letheen broth)
- 카세인 소화 대두 레시친 폴리소르베이트 20 액체 배지(Casein Peptone Lecithin Polysorbate broth)
- 디-이 중화 액체배지(D-E Neutralizing broth)
- 변형 카세인 대두 소화 액체 배지(Modified Tryptic soy broth)

3.2.1.2.2 검출용 한천 배지
하기의 검출용 한천 배지를 사용하는 것을 원칙으로 하며 “방부제 중화능 시험”을 통해 검증된 다른 검출용 한천 배지도 사용 가능하다.
- 변형 레틴 한천 배지(Modified letheen agar)
- 레틴 한천 배지(letheen agar)
- 변형 카세인 대두 소화 한천 배지(Modified Tryptic soy agar)
- 사브로우드 덱스트로즈 한천배지(Sabouraud Dextrose agar)
- 포테이토 덱스트로즈 한천배지(Potato dextrose agar)

3.2.1.3 조작

3.2.1.3.1 세균수 시험
직경 8.5~10cm 페트리 접시 내에 미리 굳힌 검출용 한천 배지 표면에 전처리 된 검액 최소 0.1mL씩을 도말한다. 또는 검액 1mL 씩을 같은 크기의 페트리접시에 넣고 그 위에 멸균 후 45℃ 이하로 식힌 10~20mL의 검출용 한천 배지를 넣어 잘 혼합하고, 30~35℃에서 48시간 배양한다. 이때 30~300 개의 균 집락을 형성한 평판을 취한 다음, 희석배율을 곱하여 이를 세균수로 한다.

3.2.1.3.2 진균수 시험
세균수 시험에 따라 시험을 실시하되 배지는 검출용 한천 배지를 사용하여 배양온도 22~28℃에서 3~5일간 배양한다. 이때 100개 이하의 균 집락을 형성한 평판을 취한 다음, 희석배율을 곱하여 이를 진균수로 한다.

3.2.2 방부제 중화능 시험
필요에 따라 다음의 시험을 실시한다.
표1의 시험균주로 완충 식염 펩톤수(pH 7.0)를 사용하여 시험균액을 만든다.
검체를 10배 희석한 희석액과 검체를 포함하지 않는 희석액에 1mL당 100~300개의 생균이 함유되도록 시험균액을 접종한다. 각각을 시험군과 대조군으로 하여 총 호기성 생균수 시험을 실시하며 시험군과 대조군의 균수를 비교하여 50% 이상의 차이가 나타나서는 안된다.

1. 방부제 중화능 시험용 균주 및 배양 조건

시험균주                                                                      배양
Staphylococcus aureus KCTC 3881 (ATCC 6538)        호기배양30~35℃에서 
Pseudomonas aeruginosa KCTC 2513(ATCC 9027)     18-24 시간 배양
Escherichia coli KCTC 2571(ATCC 8739)

Candida albicans KCTC 17205(ATCC 10231)              호기배양30~35℃에서 48시간 배양

3.3 특정세균 시험법
총 호기성 생균수 시험에서 세균이 검출되지 않으면 특정세균 음성으로 판정하고, 검출된 경우 특정세균 시험을 실시한다.
특정 세균 시험은 다음의 일반적인 특정세균 검출 방법 외에 미생물 동정용 기기나 키트를 사용 할 수도 있다.

3.3.1 대장균 시험법
대장균은 그람 음성간균으로 운동성을 갖는 장내세균이며, 유당을 발효하여 가스를 생성하는 통성 혐기성 세균을 말한다. 시험 방법은 다음과 같다.

3.3.1.1 검액의 조제 및 조작
검출된 세균의 집락을 백금이 등으로 취하여 맥콘키 한천 배지 위에 도말하고 30~35℃에서 18~24시간 배양한다. 주위에 적색의 침강선띠를 갖는 적갈색의 그람음성균의 집락이 검출되지 않으면 대장균 음성으로 판정한다. 위의 특정을 나타내는 집락이 검출되는 경우에는 에오신 메칠렌블루 한천 배지에서 각각의 집락을 도말하고 30~35℃에서 18~24시간 배양한다. 에오신 메칠렌블루 한천 배지에서 금속광택을 나타내는 집락 또는 투과광선 하에서 흑청색을 나타내는 집락이 발견되면 백금이등으로 취하여 발효시험관이 든 유당액체배지에 넣어 44.3~44.7℃의 항온수조중에서 22~26시간 배양한다. 가스발생이 나타나는 경우에는 대장균 양성으로 판정한다.

3.3.1.2 배지
- 유당 액체배지
- 맥콘키 한천배지
- 에오신 메칠렌블루 한천배지(EMB한천배지)

3.3.2 녹농균시험
녹농균은 그람음성, 단모성 또는 쌍모성 편모를 가진 무아포성간균이며 운동성이 있는 호기성 세균으로 시험방법은 다음과 같다.

3.3.2.1 검액의 조제 및 조작
검출된 세균의 집락을 백금이 등으로 취하여 세트리마이드 한천배지나 플루오레세인 검출용 녹농균 한천배지 F 또는 피오시아닌 검출용 녹농균 한천배지 P에 도말하여 35~37℃에서 72시간 배양한다. 그람음성간균으로 세트리마이드 한천 배지에서 연녹색이나 청녹색 집락이 나타나거나, 플루오레세인 검출용 녹농균 한천배지 F의 집락을 자외선 하에서 관찰하여 황색을 나타내거나, 피오시아닌 검출용 녹농균 한천배지 P의 집락을 자외선 하에서 관찰하여 청색을 나타나면 옥시다제 시험과 이동성시험을 실시한다. 집락을 염화 N, N-디메칠 p-페닐렌디아민이 묻은 여지에 옮겨 5~10초 이내에 자색으로 변색하면 옥시다제 양성이므로, 집락을 이동성 시험용 배지에 천자하여 24시간 배양한 후 이동성을 관찰한다. 옥시다제 시험과 이동성 시험에서 양성이면 카제인 소화 대두 액체배지의 42℃에서 성장여부를 실시하여 성장하면 녹농균 양성으로 판정한다.

3.3.2.2 배지
- 카제인 대두 소화 액체배지
- 플루오레세인 검출용 녹농균 한천배지 F(Pseudomonas agar F for detection of fluorescein)
- 피오시아닌 검출용 녹농균 한천배지 P (Pseudomonas agar P for detection of pyocyanin)
- 세트리마이드 한천배지
- 이동성시험용배지(motility test medium)

3.3.3 황색포도상구균 시험
황색포도상구균은 그람양성 무아포 비운동성 구균이 불규칙하게 포도송이 모양으로 배열되어 있는 호기성 또는 통성 혐기성균으로서 혈장응집반응이 양성인 균을 말하며 시험방법은 다음과 같다.

3.3.3.1 검액의 조제 및 조작
증균 배양된 배양액을 바드 파커 한천배지나 V-J 한천배지(Vogel Johnson agar)에 도말하여 35~37℃에서 24시간 배양한다. 그람 양성 구균으로 Bard Parker 한천 배지에서 균의 집락이 광택을 띠는 검정색이고 집락주위에 2~5mm의 투명대가 형성되거나, V-J 한천배지에서 균의 집락이 검정색이고 집락 주위에 황색투명대가 형성되면 응고효소시험을 실시한다.
백금이등으로 의심이 되는 집락을 취하여 포유류 유래의 0.5mL의 혈장을 포함하는 시험관에 접종하고 대조군과 함께 37℃에서 배양한다. 3시간 후에 응고 유무를 1차 확인하고 그 후 24시간까지 응고 유무를 확인한다.
응고가 관찰되면 황색포도상구균 양성으로 판정한다.

3.3.3.2 배지
- V-J 한천배지(Vogel-Johnson agar)
- 바드 파커 한천 배지(Baird Parker agar)

4. 경과 조치

ｏ 본 시험법은 2004년 5월부터 시행하기로 한다.
ｏ 다만 본 규약의 시행에 어려움이 있는 중소기업은 별도의 유예기간을 설정할 수 있도록 건의한다.
ｏ 본 시험법의 대상제품을 제외한 기타 제품의 경우는 총 호기성 생균(세균, 진균)수가 1,000 CFU/ｇ(mL)이하가 되어야 한다